LAPORAN PRAKTIKUM
GENETIKA
“EKSTRAKSI DNA DAN ELEKTOFORESIS DNA “
Disusun oleh:
LINDA RAHMAWATI (1201070034)
Semester 3 B
PROGAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS
KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS
MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2013/2014
EKSTRAKSI
DNA DAN ELEKTOFORESIS DNA
I.
TUJUAN
1. Mengekstraksi secaraa lagnsung DNA
pada daun kelapa.
2. Mengetahui tata cara dalam
mengekstraksi DNA.
3. Untuk melihat secara langsung bentuk
dari ekstrak DNA
4. Mengetahui tata cara dalam
mengelektroforensis DNA
5. Untuk melihat secara langsung bentuk
DNA kelapa dibawah sinar UV.
II.
DASAR TEORI
Molekul DNA di dalam suatu sel dapat
diekstraksi atau diisolasi untuk digunakan
dalam berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA
denagan cara elektroforesis. DNA diisolasi bertujuan untuk memisahkan DNA dari
bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam
isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA
dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA). Terdapat
beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA ini antara lain
harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA;
metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang
dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya
harus sederhana dan cepat.
Prisnsip isolasi DNA pada berbagai
jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun
memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa
teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu
perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan
seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan
GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi DNA dalam
setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan.
Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan
kekurangan. Metode konvensional memiliki kelebihan harga lebih murah dan
digunakan secara luas sementara kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif
lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.
Elektroforesis
adalah suatu teknik pemisahan molekul selilar berdasarkan atas ukurannya,
dengan menggunakan medan
listrik yag dialirkan pada suau medium yang mengandung sampel yahg akan
dipisahkanan. Teknik ini dapat digunakan dengaq memanfaatkan muatan listrik
yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul
yang negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarossa, kemudian
dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan
gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya,
serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.Teknik elektroforensis dapat
digunakan untuk analisis DNA, RNA, maupun protein. Elektroforensis DNA
dilakukan misalnya untuk mengkatalisis fragmen- fragmen DNA hasil pemotongan
dengan enzim reaksi.
Elektroforesis
melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan metode standar untuk
pemisahan, identifikasi dan pemurnian fragmen DNA. Selain itu elektroforensis
gel poliakrilamid dapat juga digunakan untuk pemisahan, identifikasi dan
pemurnian protein. Teknik ini merupakan teknik sederhana, cepat dan dapat
memisahkan molekul yang diinginkan dari matriknya yang tidak dapat dilakukan
oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradient. Agarosa yag didasari oleh
ganggang laut, merupakan polimer dengga struktur D-galaktosa dan3,6-anhidro
L-galaktosa. Gel agarossa mempunyai daya pemisahan lebih rendah jika
dibandingkan dengan jel poliakrilamid, tetapi mempunyai rentang pemisahan lebih
besar. DNA dari 200 bisa sampai 50 kilobrosa dapat dipisahkan dengan gel
agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal dalam
kekuatan medan listrik dan arah tetap.
III.
ALAT DAN BAHAN
A. Ekstraksi DNA (Isolasi DNA)
v Alat:
-
Waterbath
-
Thermometer
-
Mortal
-
Stopwatch
-
Micro pipet
-
Sentrifuga
-
Simpeltubes
-
Ependorf
-
Sarung tangan
-
Kacamata
-
Microotube
-
Microsentrifuge
-
Gunting
v Bahan:
-
Ethanol
-
Isoamil alkohol:kloroform
-
Daun kelapa
-
Nitrogen cair
-
Larutan CTAB
B. Gel Elektoforensis
v Alat:
-
Tabung erlenmayer
-
Gel comb
-
Gel tray
-
Mesin elektroforensis
-
Microwife
-
Pipet tips
-
Mesin vortex
-
Micropipet
-
PCR tube
-
Mesin UV
v Bahan:
-
Agarosa
-
TBE
buffer
-
DNA standard
-
DNA sampel
-
Etidhium bromida
IV.
CARA KERJA
A. EKSTRAKSI
DNA METODE CTAB (HOISINGTON,1992)
1. Menggunakan
alat pelindung kerja, seperti jas lab, sarung tangan, kaca mata,dan sepatu yang
tertutup.
2. Memenasi
larutan CTAB yang telah disiapkan sebelumnya,(membuat fresh)sebanyak 2ml dalam
tabung reaksi dengan menggunakan waterbath pada suhu 65oc.
3. Mengambil
daun pertama atau kedua dengan berat sekitar 1gram(gr), yang selanjutnya
meletakkan kedalam mortal dan menuangkan nitrogen cair secukupnya kedalam
mortal.
4. Menggerus
daun kelapa didalam mortal secepat cepatnya, sebelum nitrogen yang dicampurkan
menguap, menggerus daun sampai benar benar halus menjadi tepung.
5. Setelah
nitrogen cair menguap, maka memasukkan tepung daun yang telah jadi tersebut
kedalam larutan CTAB yang telah disiapkan (nomor1)
6. Mengingkubasikan
campuran tepung dan CTAB pada wterbath selama 1jam, pada suhu 65oC.
Mengocok tabung setiap 15 menit sekali.
7. Melakukan
sentrifugasi pada sampel yang diperoleh dengan kecepatan 6000 rpm selama 20
menit.
8. Memindahkan
supernatant ketabung ependorf 2 ml dan
kembali melakukan sentrifugasi kembali selama 20 menit dengan kecepatan 11000rpm.
9. Memindahkan
supernatant kedalam tabung yang baru yang telah disiapkan, sebanyak 1 ml dan
menambahkan campuran isoamil alkohol: klorofom (1:24) sebanyak 0,5ml.
10. Kemudian
menyampur sampel dengan cara flicking sampai bercampur kemudian melakukan
sentrifugasi kembali selama 10 menit dengan kecepatan 11000rpm.
11. Selanjutnya
adalah memindahkan bagian atas dari larutan kedalam tabung ependorf yang baru
dan kemudian menambahkan ethanol absolut (5oC) dan juga menambahkan
100 uL. Secara perlahan lahan.
12. Kemudian
menyampur secara perlahan dan menyimpanya didalam lemari es(5oC)
selama 1 malam agar DNA tersebut dapat mengendap dan menggumpal.
B. ELEKTROFORESIS
v Pembuatan
Agarosa 1%
1. Memasukkan
agarosa pada tabung erlenmayer untuk ukuran besar 1,5 gr dengan menambahkan 150
TBE buffer , kemudian menimbang serta mencatatn beratnya.
2. Memasukkan
agarosa pada tabung erlenmayer untuk ukuran besar 0,4 gr dengan menambahkan 40
TBE buffer , kemudian menimbang serta mencatatn beratnya.
3. Memasukan
kedua tabung yang berisi Agarosa+ TBE buffer kedalam microwave , menunggu
sampai larut.
4. Menimbang
kembali dan menambahkan TBF buffer bila terdapat selisih antara sebelum dan
sesudah memanaskannya didalam microwave.
5. Menuangnya
kedalam tray sampai menyerap dan mengeras kemudian mengambil comb
v Elektroforesis
1. Menyiapkan
elektroforensis 75 volt, DNA sample, loading DNA, dan DNA strandar.
2. Memasukan
gel agarosa kedalam mesin elektroforesis dan kemudian memasukan TBE buffer
hingga gel Agarosa terendam.
3. Memasukan
loading DNA kedalam PCR tube sebenyak 6 µC dan menambahkan DNA sample
kedalamnya sebanyak 25 µC, kemudian memassukannya keddalam sumur gel Agarosa.
4. Memasukan
loading DNA kedalam PCR tube sebenyak 6 µC dan menambahkan DNA standar
kedalamnya sebanyak 6 µC, kemudian memassukannya keddalam sumur gel Agarosa.
5. Merun
mesin elektroforesis selama 1-1,5 jam
6. Mengambil
gel agarosa dan kemudian memasukannya kedalam larutan etidium bromide selama 30
menit.
7. Mencuci
agaraosa sebanyak 2 kali dengan aquades.
8. Mengamati
gel agarosa di bawah sinar UV
V.
HASIL KERJA
|
|
||||
|
|
|
|
||||
VI.
PEMBAHASAN
Dalam praktikum praktikum untuk
mengetahui adanya DNA pada kelapa, pertama-tama adalah melakukan ekstraksi DNA
menggunakan metode CTAB. Cetyl
trimethylammonium bromide (CTAB) ini sering dipakai untuk melisiskan
membran sel pada isolasi DNA tumbuhan. Parameter keberhasilan dalam penggunaan
CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0
M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet
sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan
NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang
mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA
bersifatinsolublepada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan
kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan
sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel
diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah
pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15°C. Setelah dilakukan
ekstraksi DNA dengan metode CTAB ini dihasilkan larutan DNA yang berwarna putih
dan diperkirakan terdapat DNA di dalamnya.
Untuk meengetahui bahwa hasil
ekstraksi DNA tersebut terdapat DNA maka dilakukan elektroforesis pada larutan
hasil ekstraksi tersebut. Elektroforensis adalah suatu teknik
pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan
listrik yag dialirkan pada suau medium yang mengandung sampel yahg akan
dipisahkanan. Teknik ini dapat digunakan dengaq memanfaatkan muatan listrik
yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul
yang negatif dilewatkan melalui suatu medium seperti gel agarosa, kemudian
dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan
gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya,
serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.
Kemudian
setelah dilakukan gel elektroforesis pada DNA hasil ekstrasi tadi, kemudian cara
yang paling mudah untuk mendeteksi adanya DNA adalah dengan menggunakan etidium
bromide, suatu senyawa berfluorensi yang biasanya digunakan untuk mendeteksi
DNA pada gel agarosa atau poliakrimid. Senyawa ini sangat karsinogenik sehingga
diperlakukan dengan sangat hati-hati. Senyawa ini berinteraksi diantara untai
sepanjang molekul DNA. Radiasi ultraviolet pada 254 nm diabsorpsi oleh DNA dan
ditransmisikan pata etidium bromide; radiasi pada 302 nm, 366nm diserap oleh
etidium bromide. Pada kedua keadaan ini energinya dipancarkan pada 590 nm pada daerah jingga-
merah. Etidium bromide dapat digunakan untuk deteksi baik asam nukleat untai
tunggal maupun untai ganda (RNA dan DNA), akan tetapi afinitas etidium bromide
pada asam nukleat untai tunggal relative rendah dan hasil fluorensinya kurang jika dibandingkan dengan
untai ganda.
Pada praktikum elektroforesis ini
dihasilkan bahwa tidak terdapat DNA yang dapat diketahui dari penyinaran sinar
UV. Hal ini mungkin dikearenakan adanya kesalahan teknis dalam pembuatan
ekstrak DNA atau dalam tata cara elektroforesis ini. Kemungkinan ini dikuatkan
karena dalam praktikum proses vortex dalam pencairan dan pencampuran DNA tidak
dilakuakan dan kemungkinan tidak adannya DNA ini bias saja diarenakan memang
tidak ada DNA yang terdapat dalam cairan ektraksinya.
VII.
KESIMPULAN
1. Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) ini digunakan
dalam ekstraksi DNA adalah untuk
melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan.
2. Setelah dilakukan ekstraksi DNA
dengan metode CTAB dapat dihasilkan larutan DNA yang berwarna putih dan
diperkirakan terdapat DNA di dalamnya.
3. DNA diisolasi bertujuan untuk
memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
4. Elektroforensis
adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya,
dengan menggunakan medan listrik yag dialirkan pada suau medium yang mengandung
sampel yahg akan dipisahkanan.
5. Jika
molekul yang negatif dilewatkan melalui suatu medium seperti gel agarosa,
kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan
muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif.
6. Untuk
mendeteksi adanya DNA adalah dengan menggunakan etidium bromide, suatu senyawa
berfluorensi yang biasanya digunakan untuk mendeteksi DNA pada gel agarosa.
7. Etidium
bromide ini sangat karsinogenik sehingga diperlakukan dengan sangat hati-hati.
Senyawa ini berinteraksi diantara untai sepanjang molekul DNA.
8. Radiasi
ultraviolet pada 254 nm diabsorpsi oleh DNA dan ditransmisikan pata etidium
bromide; radiasi pada 302 nm, 366nm diserap oleh etidium bromide.
9. Etidium
bromide dapat digunakan untuk deteksi baik asam nukleat untai tunggal maupun
untai ganda (RNA dan DNA), akan tetapi afinitas etidium bromide pada asam
nukleat untai tunggal relative rendah dan hasil
fluorensinya kurang jika dibandingkan dengan untai ganda
10. Kemungkinan tidak adanya DNA dalam praktikum
ini dikuatkan karena dalam praktikum proses vortex dalam pencairan dan
pencampuran DNA tidak dilakuakan dan kemungkinan tidak adannya DNA ini bias
saja diarenakan memang tidak ada DNA yang terdapat dalam cairan ektraksinya.
VIII.
DAFTAR PUSTAKA
1. Suryo
.1994. Genetika Manusia. Yogyakarta :
Gajah Mada University Press
2. Sudjadi.2008.Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta:
Kosinus
3. Yatim
, Wildan .1996. Genetika. Bandung :
Trasito
4. Yuwono,
Triwibowo.2008. Biologi Molekuler.
Jakarta: Erlangga
Tidak ada komentar:
Posting Komentar